酸性磷酸酶检测试剂盒

产品编号	产品名称	试剂组成	包装
BC-002	酸性磷酸酶检测试剂盒	检测缓冲液 15ml×2	96次
		20×pNPP底物 500μl×2
		p-nitrophenol溶液(10mM) 250μl
		反应终止液 6ml

 
产品信息：
 百智生物生产的酸性磷酸酶检测试剂盒(Acid Phosphatase Assay Kit)是一种用于快速、便捷地检测细胞或组织样品的裂解或匀浆产物的上清液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的酸性磷酸酯酶活性的试剂盒。
      酸性磷酸酶(Acid Phosphatase)，也称酸性磷酸酯酶，是一种在溶酶体中含量较高的酸性水解酶，被认为是鉴定溶酶体亚细胞组分的标志物。酸性磷酸酶是一个蛋白家族，哺乳动物中其分子量从18kD到100kD不等。血浆中的酸性磷酸酶活性范围在2-7.9U/L，血清中酸性磷酸酶的活性范围在2.5-11.7U/L。精液(semen)中含有高浓度的酸性磷酸酯酶，活力可以达到87-436KU/L。
       Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)是一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在酸性磷酸酶作用下生成para-nitrophenol。para-nitrophenol (p-nitrophenol)在碱性条件下，呈黄色产物，可以在400-415nm检测吸光度。产物黄色越深， 说明酸性磷酸酶检活性越高，反之则酶活性越低。据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。
      包括标准品和空白对照，本试剂盒共可进行96次检测。
 
保存条件：
 -20℃保存，一年有效。其中pNPP底物和p-nitrophenol溶液需避光保存。


注意事项：
      样品溶液中须避免出现EDTA、氟离子、柠檬酸盐等酸性磷酸酶的抑制剂。
      检测缓冲液和p-nitrophenol溶液对人体有害，请注意适当防护。反应终止液有腐蚀性，请小心操作。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗。
      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 
 
使用说明：
1. 试剂准备：将所有试剂取出，平衡至室温使用。 
标准品工作液：取10μl  p-nitrophenol溶液(10mM)，用检测缓冲液稀释至0.2ml，最终浓度为0.5mM。
2. 样品准备：
酸性磷酸酶在4℃条件下一般可稳定48小时；如长期保存可放置于-20℃以下，一般可稳定2个月左右，需避免反复冻融。
a. 细胞上清或裂解液的检测：细胞培养上清可直接用于检测无需前处理；如测定细胞内酸性磷酸酶含量，对于悬浮培养的细胞4℃ 2000×g 离心5min进行收集；对于贴壁培养的细胞务必不要使用胰酶等蛋白水解酶，应使用细胞橡胶刮铲进行收集。将收集后的细胞加入适量冷的50mM Tris-Hcl（PH=7.4）缓冲液中使终浓度大约为1×10⁵Cell/ml，超声破碎后4℃ 14000×g 离心10min，最后取上清用于检测。
 b. 血浆、血清和尿液的准备：血浆和血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。血浆制备时不能用含EDTA和柠檬酸盐等酸性磷酸酶抑制剂的抗凝管。尿液通常也可以直接用于测定。
c. 组织的准备：在切割组织之前，请先用TBS（PH=7.4） 缓冲液清洗掉组织上的血。然后剪切下50mg的组织放入200μl 50mM Tris-Hcl（PH=7.4）缓冲液中进行均浆，然后4℃ 14000×g 离心10min，最后取上清用于检测。
d. 样品的稀释：如果样品中含有较高活性的酸性磷酸酶，可以采用试剂盒中的检测缓冲液进行稀释。如果使用试剂盒中提供的检测缓冲液进行稀释，需注意保留足够的检测缓冲液用于试剂盒的检测过程。
3. 参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。标准品的用量分别为4、8、16、24、32和40μl，样品通常可以直接加50μl。如果样品中的酸性磷酸酶活性过低无法检出可以增加样品用量；如果样品中的酸性磷酸酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。
 

酸性磷酸酶检测溶液的配制
	空白对照（Blank）	标准品孔加样模式	样品孔加样模式
检测缓冲液	190μl	（200-x）μl	（190-y）μl
20×pNPP底物	10μl	/	10μl
样品	/	/	y μl
标准品工作溶液	0μl	x μl	/

 
4. 用枪头轻轻吹打混匀，也可借助摇床进行混匀。
5. 37℃孵育30min。
6. 每孔加入50μl反应终止液终止反应。此时，标准品或有酸性磷酸酶活性的孔会呈现不同深浅的黄色。
7. 在405nm测定吸光度。如果不能测定405nm，也可以在400-415nm范围内检测吸光度。
8. 酸性磷酸酶活性单位的定义：在pH4.8，37℃条件下，每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的酸性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位。