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碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)定量测定试剂盒

时间:2018-02-25 11:05来源:未知 作者:admin 点击:
碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)定量测定试剂盒 96T 300元(货号BCEA004-96)
碱性磷酸酶检测试剂盒
产品编号 产品名称 试剂组成 包装
BC-001 碱性磷酸酶检测试剂盒  检测缓冲液 15ml×2 100次
20×pNPP底物 500μl×2
p-nitrophenol溶液(10mM) 250μl
反应终止液 6ml
 
产品信息:
百智生物生产的碱性磷酸酶检测试剂盒(Alkaline Phosphatase Assay Kit)是一种用于快速、便捷地检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血清、血浆、尿液等样品中内源性的碱性磷酸酶活性的试剂盒。
      碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AP/ALP/ALPase)也称碱性磷酸酯酶,可以在碱性条件下催化磷酸酯键的水解。哺乳动物中,肝脏、胆管、肾脏、骨头和胎盘中的碱性磷酸酶活性比较高。常见的碱性磷酸酶包括肠道碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, intestinal, ALPI)、非组织特异性碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, tissue-nonspecific isozyme, ALPL)和胎盘碱性磷酸酶(placental alkaline phosphatase, PLAP)。
     pNPP是一种常用的磷酸酶显色底物,在碱性条件下,可在碱性磷酸酶作用下生成p-nitrophenol。p-nitrophenol在碱性条件下,呈黄色产物,可以在400-415nm检测吸光度。产物黄色越深,说明碱性磷酸酶检活性越高,反之则酶活性越低。据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。
      包括标准品和空白对照,本试剂盒共可进行100个样品的检测。
 
保存条件:
 -20℃保存,一年有效。其中pNPP底物和p-nitrophenol溶液需避光保存。


注意事项:
      样品溶液中须避免出现EDTA、氟离子、柠檬酸盐等碱性磷酸酶的抑制剂。
      检测缓冲液和p-nitrophenol溶液对人体有害,请注意适当防护。反应终止液有腐蚀性,请小心操作。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗。
      为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 
 
使用说明:
1. 试剂准备:将所有试剂取出,平衡至室温使用。 
标准品工作液:取10μl  p-nitrophenol溶液(10mM),用检测缓冲液稀释至0.2ml,最终浓度为0.5mM。
2. 样品准备:
碱性磷酸酶在4℃条件下一般可稳定48小时;如长期保存可放置于-20℃以下,一般可稳定2个月左右,需避免反复冻融。
a. 细胞上清或裂解液的检测:细胞培养上清可直接用于检测无需前处理;如测定细胞内碱性磷酸酶含量,对于悬浮培养的细胞4℃ 2000×g 离心5min进行收集;对于贴壁培养的细胞务必不要使用胰酶等蛋白水解酶,应使用细胞橡胶刮铲进行收集。然后用冷PBS冲洗大约104个收集后的细胞,并将冲洗后的细胞加入0.5ml 0.2% Triton X-100水溶液中室温震荡20min进行裂解并进行后续检测。
b. 血浆、血清和尿液的准备:血浆和血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定,但为了消除样品本身颜色的干扰,需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。血浆制备时不能用含EDTA和柠檬酸盐等碱性磷酸酶抑制剂的抗凝管。尿液通常也可以直接用于测定。
c. 组织的准备:在切割组织之前,请先用TBS(PH=7.4) 缓冲液清洗掉组织上的血。然后剪切下50mg的组织放入200μl 50mM的Tris-Hcl(PH=7.4)缓冲液中进行均浆,然后4℃ 14000×g 离心10min,最后取上清用于检测。
d. 样品的稀释:如果样品中含有较高活性的碱性磷酸酶,可以采用试剂盒中的检测缓冲液进行稀释。如果使用试剂盒中提供的检测缓冲液进行稀释,需注意保留足够的检测缓冲液用于试剂盒的检测过程。
3. 参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。标准品的用量分别为4、8、16、24、32和40μl,样品通常可以直接加50μl。如果样品中的碱性磷酸酶活性过低无法检出可以增加样品用量;如果样品中的碱性磷酸酶活性过高,可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。
 
碱性磷酸酶检测溶液的配制
  空白对照(Blank) 标准品孔加样模式 样品孔加样模式
检测缓冲液 190μl (200-x)μl (190-y)μl
20×pNPP底物 10μl / 10μl
样品 / / y μl
标准品工作溶液 0μl x μl /
 
 
4. 用枪头轻轻吹打混匀,也可借助摇床进行混匀。
5. 37℃孵育10min。
6. 每孔加入50μl反应终止液终止反应。此时,标准品或有碱性磷酸酶活性的孔会呈现不同深浅的黄色。
7. 在405nm测定吸光度。如果不能测定405nm,也可以在400-415nm范围内检测吸光度。
8. 碱性磷酸酶活性单位的定义:在pH9.8的diethanolamine(DEA)缓冲液中,37℃条件下,每分钟水解pNPP显色底物产生1μM  p-nitrophenol所需的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位,也被称作一个DEA酶活力单位。
9. 根据酶活性定义,计算出样品中的碱性磷酸酶活性。



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