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酸性磷酸酶(Acid phosphatase)定量测定试剂盒

时间:2018-02-25 11:06来源:未知 作者:admin 点击:
酸性磷酸酶(Acid phosphatase)定量测定试剂盒 96T 300元(货号BCEA005-96)
酸性磷酸酶检测试剂盒
产品编号 产品名称 试剂组成 包装
BC-002 酸性磷酸酶检测试剂盒  检测缓冲液 15ml×2 96次
20×pNPP底物 500μl×2
p-nitrophenol溶液(10mM) 250μl
反应终止液 6ml
 
产品信息:
 百智生物生产的酸性磷酸酶检测试剂盒(Acid Phosphatase Assay Kit)是一种用于快速、便捷地检测细胞或组织样品的裂解或匀浆产物的上清液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的酸性磷酸酯酶活性的试剂盒。
      酸性磷酸酶(Acid Phosphatase),也称酸性磷酸酯酶,是一种在溶酶体中含量较高的酸性水解酶,被认为是鉴定溶酶体亚细胞组分的标志物。酸性磷酸酶是一个蛋白家族,哺乳动物中其分子量从18kD到100kD不等。血浆中的酸性磷酸酶活性范围在2-7.9U/L,血清中酸性磷酸酶的活性范围在2.5-11.7U/L。精液(semen)中含有高浓度的酸性磷酸酯酶,活力可以达到87-436KU/L。
       Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)是一种常用的磷酸酶显色底物,在酸性条件下,可在酸性磷酸酶作用下生成para-nitrophenol。para-nitrophenol (p-nitrophenol)在碱性条件下,呈黄色产物,可以在400-415nm检测吸光度。产物黄色越深, 说明酸性磷酸酶检活性越高,反之则酶活性越低。据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。
      包括标准品和空白对照,本试剂盒共可进行96次检测。
 
保存条件:
 -20℃保存,一年有效。其中pNPP底物和p-nitrophenol溶液需避光保存。


注意事项:
      样品溶液中须避免出现EDTA、氟离子、柠檬酸盐等酸性磷酸酶的抑制剂。
      检测缓冲液和p-nitrophenol溶液对人体有害,请注意适当防护。反应终止液有腐蚀性,请小心操作。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗。
      为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 
 
使用说明:
1. 试剂准备:将所有试剂取出,平衡至室温使用。 
标准品工作液:取10μl  p-nitrophenol溶液(10mM),用检测缓冲液稀释至0.2ml,最终浓度为0.5mM。
2. 样品准备:
酸性磷酸酶在4℃条件下一般可稳定48小时;如长期保存可放置于-20℃以下,一般可稳定2个月左右,需避免反复冻融。
a. 细胞上清或裂解液的检测:细胞培养上清可直接用于检测无需前处理;如测定细胞内酸性磷酸酶含量,对于悬浮培养的细胞4℃ 2000×g 离心5min进行收集;对于贴壁培养的细胞务必不要使用胰酶等蛋白水解酶,应使用细胞橡胶刮铲进行收集。将收集后的细胞加入适量冷的50mM Tris-Hcl(PH=7.4)缓冲液中使终浓度大约为1×105Cell/ml,超声破碎后4℃ 14000×g 离心10min,最后取上清用于检测。
 b. 血浆、血清和尿液的准备:血浆和血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定,但为了消除样品本身颜色的干扰,需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。血浆制备时不能用含EDTA和柠檬酸盐等酸性磷酸酶抑制剂的抗凝管。尿液通常也可以直接用于测定。
c. 组织的准备:在切割组织之前,请先用TBS(PH=7.4) 缓冲液清洗掉组织上的血。然后剪切下50mg的组织放入200μl 50mM Tris-Hcl(PH=7.4)缓冲液中进行均浆,然后4℃ 14000×g 离心10min,最后取上清用于检测。
d. 样品的稀释:如果样品中含有较高活性的酸性磷酸酶,可以采用试剂盒中的检测缓冲液进行稀释。如果使用试剂盒中提供的检测缓冲液进行稀释,需注意保留足够的检测缓冲液用于试剂盒的检测过程。
3. 参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。标准品的用量分别为4、8、16、24、32和40μl,样品通常可以直接加50μl。如果样品中的酸性磷酸酶活性过低无法检出可以增加样品用量;如果样品中的酸性磷酸酶活性过高,可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。
 
酸性磷酸酶检测溶液的配制
  空白对照(Blank) 标准品孔加样模式 样品孔加样模式
检测缓冲液 190μl (200-x)μl (190-y)μl
20×pNPP底物 10μl / 10μl
样品 / / y μl
标准品工作溶液 0μl x μl /
 
 
4. 用枪头轻轻吹打混匀,也可借助摇床进行混匀。
5. 37℃孵育30min。
6. 每孔加入50μl反应终止液终止反应。此时,标准品或有酸性磷酸酶活性的孔会呈现不同深浅的黄色。
7. 在405nm测定吸光度。如果不能测定405nm,也可以在400-415nm范围内检测吸光度。
8. 酸性磷酸酶活性单位的定义:在pH4.8,37℃条件下,每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的酸性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位。

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