总一氧化氮定量检测试剂盒

产品编号	产品名称	试剂组成	包装
BCOS-005	总一氧化氮定量检测试剂盒	浓缩标准品0.1ml/支	96次
		蛋白沉淀剂I 1ml/支
		蛋白沉淀剂II 1ml/支
		NO3-还原剂 0.25ml/支
		Griess Reagent I 12.5ml/瓶
		Griess Reagent II 12.5ml/瓶

 
产品信息：
The biological activities of Nitric Oxide (NO) were first widely appreciated when it was identified as the endothelial-derived relaxing factor (EDRF) responsible for the potent vasodilating properties of stimulated endothelia (1-3). Since then, NO has been recognized as a pleiotropic biological mediator, regulating diverse activities ranging from neuronal function to immune system regulation. It is a gaseous free radical with a short half-life in vivo of a few seconds or less. Therefore, the levels of the more stable NO metabolites, nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-), have been used in the indirect measurement of NO in biological fluids. Altered levels of NO have been shown to be associated with sepsis, reproduction, infection, hypertension, exercise, type 2 diabetes, hypoxia, and cancer.
百智生物生产的总一氧化氮定量检测试剂盒采用原理如下图：

 
 
 
 
 
 
 
 
 

首先通过还原剂将样本中的NO₃^-还原为NO₂^-，而Griess Reagent与NO₂^-生成的紫色Azo产物在540nm处有最大吸收峰，颜色的深浅与总一氧化氮含量成正比。因此可以用该方法对各种动物的全血、血清或浆、尿液、唾液和组织及细胞裂解液等样本中总一氧化氮进行定量。
 
保存条件：
 -20℃保存，半年有效。
 
 
注意事项：
     本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗。
      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 
肝素管的血浆会导致Griess Reagent I试剂产生沉淀。因此，推荐使用EDTA和枸橼酸抗凝管收集血浆。
由于血红蛋白会导致Griess Reagent试剂背景上升，因此血清或浆等样品需进行去蛋白的前处理。
   RPMI 1640等含有较高浓度硝酸盐的培养液容易对本试剂盒的检测产生干扰，请尽量避免。必需使用RPMI 1640培养液时，在检测一氧化氮前必需先换成其他适当培养液例如DMEM、MEM、F12等，或换成HBSS或PBS等。
 
使用说明：
1.试剂准备：将所有试剂取出，平衡至室温使用。 
2.样品准备：
a.血浆的制备及去蛋白：（1）用枸橼酸或肝素管收集全血，切忌使用EDTA管。（2）1000g 4℃离心全血10min，移液器吸取顶部的黄色血浆层，千万不要碰触影响到白色至浅黄色的薄层。如当天检测可2-8℃保存；如不，需冻存至-80℃。（3）取100μl血浆加入干净的EP管后，依次加入10μl蛋白沉淀剂I震荡混匀，10μl蛋白沉淀剂II震荡混匀。12000rpm 4℃ 离心10min，吸取上清用于检测，此时血浆已经被稀释1.2倍。
b.血清的制备及去蛋白：（1）使用不含抗凝剂的采血管收集全血， 25℃自然凝结30min。（2）2000g 4℃离心全血15min，移液器吸取顶部的黄色血清层，千万不要碰触影响到白色至浅黄色的薄层。如当天检测可2-8℃保存；如不，需冻存至-80℃，一个月有效。（3）取100μl血浆加入干净的EP管后，依次加入10μl蛋白沉淀剂I震荡混匀，10μl蛋白沉淀剂II震荡混匀。12000rpm 4℃ 离心10min，吸取上清用于检测，此时血浆已经被稀释1.2倍。
c.尿液的准备：由于尿液中总一氧化氮含量较高因此建议用纯化水进行1:10~1:50稀释，稀释后可直接检测。
d.组织匀浆的制备及去蛋白：（1）使用PH=7.4的冷PBS溶液漂洗组织，洗去所有的红细胞及血块。（2）剪碎组织，按5ml/g组织的量加入20mM PH=7.4 PBS缓冲液进行组织匀浆，然后10000g 4℃离心15min。（3）取120μl离心后的上清加入干净的EP管后，依次加入10μl蛋白沉淀剂I震荡混匀，10μl蛋白沉淀剂II震荡混匀。12000rpm 4℃ 离心10min，吸取上清用于检测。
3.100μM 标准品作液：在495μl反应缓冲液中加入5μl浓缩标准品，充分混匀即可。
4.总一氧化氮检测工作液的配制：根据样品数量，按40体积Griess Reagent I中加1体积NO₃^-还原剂和40体积Griess Reagent II配制适量反应工作液，充分混匀，需在1小时内使用。
5.在96孔板内按照下表对板孔进行编号及加样：

	空白孔	标准品孔	样品测定孔
去离子水	100μl
100μM标准品作液	/	100μl	/
待测样品上清	/	/	100μl
检测工作液	200μl	200μl	200μl

   按照上表加完后，封上盖板膜将微孔板放置60℃孵育10min，到时间后取出微孔板放入37℃温箱孵育60min，然后取出放入酶标仪内520~560nm处进行读值。
6.样品中总一氧化氮的定量计算：
样本总一氧化氮含量（μM）=（样品孔OD值-空白孔OD值）/（标准品孔OD值-空白孔OD值）×标准品浓度（100μM）×n（稀释因子）